TEMATYKA POKAZÓW
W LABORATORIACH

VIII FESTIWAL NAUKI 
Wydział Farmaceutyczny AM w Warszawie

Rola endogennych opioidów w odczuwaniu bólu
Wykład wprowadzający
(prof. ndzw. dr hab. Helena Makulska-Nowak)¹

Ból pełni w organizmie ważną fizjologiczną rolę sygnalizacyjną, jednak zbyt silny lub przewlekle utrzymujący się uczestniczy w wielu zjawiskach patologicznych. Okazuje się, że w układzie nerwowym występują naturalne substancje przeciwbólowe łączące się z tymi samymi receptorami, co morfina.
Doświadczalne potwierdzenie istnienia receptora opioidowego w początkach lat siedemdziesiątych zapoczątkowało intensywne poszukiwania związków, wytwarzanych w organizmach ludzi i zwierząt, które w warunkach fizjologicznych mogą łączyć się z tym receptorem. Badania doprowadziły do odkrycia związków o właściwościach morfinopodobnych w różnych tkankach, głównie w mózgu, przysadce i rdzeniu kręgowym. Dla tych wszystkich substancji przyjęto ogólną nazwę "endorfiny", wywodzącą się z połączenia słów "endogenne" i "morfiny".
Odkrycie opioidów zapoczątkowało określenie budowy dwóch peptydów endogennych wyodrębnionych przez Hughesa w 1975 roku, które nazwano enkefalinami. Wraz z tym odkryciem rozpoczął się jeden z najważniejszych etapów w rozwoju badań nad percepcją bólu oraz mechanizmami działań opioidów.
W ślad za odkrywaniem kolejnych endogennych opioidów prowadzono intensywne badania nad ich właściwościami i znaczeniem w stanach fizjologicznych i patologicznych organizmu. Pomimo znacznego postępu wiedzy o endorfinach, ich rola nie jest w pełni poznana. Wiadomo, że mogą one pełnić rolę zarówno neuroprzekaźników, jak i neuromodulatorów. Wykazano ich udział w wielu ważnych czynnościach życiowych - tym związkom przypisuje się nie tylko fizjologiczną rolę w percepcji bólu, ale także w mechanizmach stresu, zjawiskach immunologicznych, regulacji łaknienia, temperatury ciała, czynności układu krążenia i układu oddechowego, w procesach uczenia i pamięci, a także w regulacji nastroju.
Przypuszcza się, że endorfiny biorą także udział w patofizjologii niektórych chorób.
Endogenne opioidy (endorfiny) hamują rozprzestrzenianie się impulsów bólowych poprzez wiązanie z receptorami opioidowymi. Znajomość mechanizmów ich działań być może umożliwi opracowanie skuteczniejszych i bezpieczniejszych metod łagodzenia bólu zarówno ostrego, jak i przewlekłego.
Pod koniec wykładu odbyła się dyskusja, a następnie rozpoczęły się pokazy laboratoryjne w siedmiu równoległych sekcjach.

Obraz molekularny pochodnej imidazolu o działaniu przeciwgrzybiczym w centrum aktywnym cytochromu P450.

Leki w świecie wirtualnym – metody obliczeniowe w farmacji
(prof. ndzw. dr hab. Dorota Maciejewska, mgr Teresa Żołek)²

W miarę wzrostu mocy obliczeniowej komputerów i doskonalenia oprogramowania stało się możliwe odwzorowywanie wielu złożonych procesów. Dziś już nikogo nie dziwi fakt, że można numerycznie symulować wybuchy jądrowe lub przewidywać sposób zgniatania karoserii samochodowych, zamiast przeprowadzać odpowiednie eksperymenty. Również w chemii i farmacji z coraz lepszymi wynikami stosuje się matematyczne modelowanie procesów, przebiegających na poziomie molekularnym. Cechą współczesnej nauki jest zanik wyraźnych granic między poszczególnymi dyscyplinami naukowymi, a szczególnie ważną, integrującą rolę w naukach biologicznych odgrywają teorie fizyki opisujące oddziaływania między atomami i cząsteczkami. Jeśli znany jest mechanizm oddziaływania leku z centrum aktywnym w organizmie (receptorem), można modelować podobne procesy przy użyciu innych, potencjalnych środków leczniczych, przewidując ich aktywność lub jej brak.
Podczas prezentacji przedstawiono różne metody wykorzystywane w projektowaniu leków oraz analizie budowy przestrzennej i właściwości molekuł. Uczestnicy spotkania mogli sprawdzić możliwości jednego z programów obliczeniowych oraz przetestować swoją wyobraźnię.

Wyciąg z aktywnej herbaty, wykazującej właściwości przeciwrodnikowe, przygotowany do pomiaru.

Pomiar zmiatania wolnych rodników przez wina i herbaty
(dr Marek Wasek, mgr inż. Jerzy Gierczyk)³

Jeszcze kilkadziesiąt lat temu tlen był uważany wyłącznie za pierwiastek niezbędny do życia. Nikt nie przypuszczał, że w stężeniu większym niż występuje w warunkach naturalnych, niektóre jego formy mogą być czynnikiem niszczącym życie. Odkrycie toksyczności tlenu było związane ze stwierdzeniem obecności wolnych rodników tlenowych w zdrowych organizmach. Powodują one uszkodzenia komórek i są szczególnie niebezpieczne dla jądra komórkowego i mitochondriów. Opublikowano wiele prac dowodzących, że rak, arterioskleroza, choroba Alzheimera czy Parkinsona mogą być związane z malejącą odpornością na działanie rodników w komórkach.
Antyoksydanty (przeciwutleniacze) eliminują wolne rodniki. Bardzo ważne jest więc stosowanie diety bogatej w antyutleniacze takie jak witamina C i E, karoteny, a również związki typu polifenoli. Związki polifenolowe takie jak: flawonoidy, antocyjany czy taniny wykazują właściwości antyutleniające, neutralizując powstające w tkankach wolne rodniki. Surowce aktywne zawierające polifenole są często głównym składnikiem wielu mieszanek ziołowych, herbat oraz preparatów leczniczych naturalnego pochodzenia, które mogą być stosowane jako dodatki do żywności. Okazuje się, że soki i wina owocowe również wykazują właściwości przeciwutleniające.
W trakcie pokazu wspólnie przyprowadzono pomiary właściwości przeciwutleniających herbat i win. Do tego celu wykorzystano technikę elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), za pomocą której można wykrywać i ilościowo oznaczać związki, zawierające niesparowany elektron, czyli wolne rodniki. Substancje antyoksydacyjne powodują zanikanie sygnałów rodników w czasie, tym szybciej, im większa jest ich aktywność.
 

Kwiatostany (szyszki) chmielu zwyczajnego (Humulus lupulus). Wyciąg z tego surowca wykazuje działanie uspokajające.

Izolacja olejków eterycznych z roślin leczniczych
(dr Jan Malinowski)⁴

Niektóre rośliny, stosowane w lecznictwie, swoje właściwości terapeutyczne zawdzięczają olejkom - lotnym, a więc pachnącym, zespołom składników naturalnych. Olejki eteryczne cechuje lotność także z parą wodną, dlatego ich napary są aromatyczne i wonne. Lotność wykorzystuje się do wyodrębnienia olejków z surowca roślinnego, np. z liści czy korzeni. Otrzymana ciecz jest mieszaniną związków chemicznych, czasem zawiera ich nawet ponad pięćdziesiąt, lecz zwykle jeden składnik jest dominujący. Na przykład olejek z liści mięty zawiera jako główny składnik mentol, olejek z owoców kminku - karwon, a olejek z kwiatostanów rumianku - chamazulen.
Olejki roślinne znalazły szerokie zastosowanie w lecznictwie. Wykazują m. in. działanie wykrztuśne, przeciwzapalne, spazmolityczne, zwiększające wydzielanie soku żołądkowego, żółci oraz moczu. Stosuje się je w leczeniu schorzeń górnych dróg oddechowych, stanów zapalnych i innych chorób przewodu pokarmowego, a także jako środki żółcio- i moczopędne. Olejki wykorzystuje się także w przemyśle kosmetycznym, perfumeryjnym i spożywczym. Wiele popularnych przypraw kulinarnych to surowce roślinne, zawierające olejki eteryczne.
W trakcie pokazu wyodrębniano olejki z surowców roślinnych, rozdzielano olejek na składniki i określano jego skład przy zastosowaniu metody chromatograficznej. Był też czas na dyskusję i pytania.

Różeniec hodowany na pożywce agarowej (agar, makro- i mikroelementy, hormony, witaminy i inne składniki)

Biofermentor do hodowli niezróżnicowanych komórek roślinnych (kalusa).

Kalus, czyli niezróżnicowana tkanka roślinna.

Biotechnologia roślin leczniczych
(przygotowanie: prof. dr hab. Mirosława Furmanowa, dr Hanna Olędzka, 
prowadzenie: dr Hanna Olędzka, mgr Wojciech Szypuła)⁵

Naturalnym środowiskiem bytowania roślin, z którym stykamy się najczęściej, jest gleba. Obecnie istnieje jeszcze inna możliwość hodowli roślin - w warunkach sterylnych, przy zastosowaniu pożywki agarowej zamiast ziemi. W takim przypadku mówimy o hodowli in vitro, czyli w szkle. Metoda ta jest m. in. stosowana do szybkiego klonalnego mnożenia roślin, tj. otrzymywania wielu okazów potomnych z tkanki jednej rośliny. Istnieje także możliwość osobnego hodowania wyodrębnionych organów tkanek i komórek roślinnych, np. samych korzeni, zarodków lub komórek. Ponadto, zamiast roślin lub ich organów można również hodować niezróżnicowaną tkankę, nazywaną kalusem, lub prowadzić hodowlę komórek w zawiesinie w tzw. bioreaktorach. W tkankach wyhodowanych in vitro występują na ogół w podobnej ilości takie same związki biologicznie czynne, jak w roślinie macierzystej, co umożliwia otrzymanie ich z pominięciem hodowli całej rośliny. Najlepsze wyniki uzyskuje się z kultury zawiesinowej w bioreaktorach, w których parametry wzrostu są automatycznie rejestrowane i kontrolowane zewnętrznie na monitorze.
Według jednej z najnowszych metod, związki lecznicze otrzymuje się z korzeni transgenicznych, tzn. mających wprowadzony obcy gen. Do modyfikacji genotypu używa się bakterii o nazwie Agrobacterium rhizogenes. Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO - genetically modified organisms) otrzymywane są obecnie z bakterii, grzybów, roślin i zwierząt. Dostarczają one m.in. wielu produktów żywnościowych, obecnych na naszym rynku. Zasady postępowania regulowane są specjalnymi przepisami, według których na opakowaniu powinna być informacja, że artykuł pochodzi z roślin zmienionych genetycznie.
Hodowla tkankowa roślin in vitro pozwala również otrzymywać rośliny haploidalne (z pojedynczym zespołem chromosomów), a także dokonywać fuzji protoplastów (nieobłonionych komórek) dwóch gatunków, nie dających mieszańców w stanie naturalnym. Tkanki można zamrażać i przechowywać w temperaturze ciekłego azotu (-196^oC), a po powolnym rozmrożeniu kontynuować hodowlę. Można również otoczkować tkanki merystematyczne i przechowywać w stanie niezmienionym w niskiej temperaturze dodatniej w formie tzw. sztucznych nasion.
Badania Katedry obejmują poszukiwania związków naturalnych o właściwościach cytostatycznych i immunomodulujących, które tworzą się w hodowli in vitro. Obecnie przedmiotem prac są różne gatunki cisa i inne rośliny nierosnące masowo w Polsce. Cis zawiera ok. 350 związków chemicznych, z których wiele jest trujących, natomiast jeden, paklitaksel, wykazuje właściwości przeciwnowotworowe. Związek ten powstaje również w hodowli in vitro. Jego obecność stwierdziliśmy w korzeniach transformowanych w ilości równej jego występowaniu w korze.
Biotechnologia jest przedmiotem zajęć dydaktycznych i badań naukowych dwóch Katedr Wydziału Farmaceutycznego - Katedry i Zakładu Biologii i Botaniki Farmaceutycznej, która zajmuje się biotechnologią roślinną oraz Katedry Technologii Środków Leczniczych, która zajmuje się biotechnologią mikroorganizmów i hodowlą grzybów.
W trakcie pokazu zostały zademonstrowane hodowle tkankowe w bioreaktorach oraz hodowle roślin transgenicznych. Nie zabrakło również czasu na dyskusję o uzyskiwaniu związków biologicznie czynnych z roślin.

Nowoczesne diagnozowanie alergii
(dr Sławomir Białek, mgr Katarzyna Gosk)⁶

Diagnostyka laboratoryjna jest działem medycyny zajmującym się dostarczaniem informacji ułatwiających bądź umożliwiających rozpoznanie i różnicowanie chorób, oraz prognozowanie i monitorowanie leczenia. W przypadku chorób alergicznych diagnoza przede wszystkim opiera się na wynikach prawidłowo przeprowadzonego wywiadu oraz na wynikach testów skórnych. Często zdarza się jednak, że obraz kliniczny nie jest potwierdzony dodatnim wynikiem testów skórnych i w takich przypadkach konieczne jest wykonanie badań laboratoryjnych, czyli oznaczenia w surowicy krwi całkowitego stężenia IgE (immunoglobuliny E) oraz stężenia immunoglobulin alergenowoswoistych.
Stężenie immunoglobuliny E w surowicy krwi jest parametrem niezwykle charakterystycznym dla procesu alergicznego. Już u małych dzieci (od trzeciego roku życia), u których obserwuje się objawy alergii pokarmowej, można wykonać oznaczenie IgE. Wysoki poziom IgE obserwuje się także u młodych dorosłych z objawami alergii na alergeny wziewne, a także u pacjentów z astmą atopową.
W trakcie tegorocznego Festiwalu Nauki w trakcie pokazów laboratoryjnych została zaprezentowana metoda oznaczania IgE alergenowoswoistych.

Przygotowywanie żelu kosmetycznego z dodatkiem unisfer, zawierających witaminę E.

Przygotowanie żelu dla młodzieży
(mgr Anna Żebrowska-Szulc, dr Barbara Chałasińska)⁷

Działanie kremów kosmetycznych, przeznaczonych do pielęgnacji skóry, polega na jej natłuszczaniu, nawadnianiu i odżywianiu, a w rezultacie na uelastycznieniu i wygładzeniu. Wartość odżywczą kremów podnosi dodatek substancji biologicznie czynnych: witamin, aminokwasów, hormonów, enzymów, kompleksów białkowych oraz wyciągów roślinnych.
Krem-żel dla młodzieży, który otrzymywano w trakcie pokazu, zawiera wyciąg z owoców Limonki (Fruitliquid Lime PG), wyciąg z liści Mięty pieprzowej (Phytoliquid Peppermint BG) oraz witaminę E. Witamina E stosowano w postaci unisfer, będących barwnymi kulistymi peletkami o średnicy od 0,5 do 0,9 mm, pełniących rolę nośników wielu aktywnych substancji. Unisfery używane w preparatach kosmetycznych różnego typu dodatkowo nadają im barwną pigmentację.

Ocena toksyczności środowiska przy użyciu organizmów wodnych
(dr Grzegorz Nałęcz-Jawecki)⁸

Bioindykacja jest metodą wykorzystującą jako wskaźnik organizm żywy, którego reakcja jest podstawą oceny stopnia toksyczności badanego środowiska. Organizmy testowe, zwane bioindykatorami, powinny być szczególnie wrażliwe na związki chemiczne szkodliwe dla środowiska i dla człowieka, a w celu poprawienia tych właściwości są one często modyfikowane genetycznie. Uzyskanie wyniku dodatniego przy ich zastosowaniu stanowi rodzaj alarmu, ostrzegającego przed przypadkowym bądź umyślnym skażeniem, i pozwala na ocenę całkowitej toksyczności próbki. Bioindykację można więc traktować jako wstęp do analizy chemicznej, która pozwala na wykrycie obecności tylko tych związków, których się spodziewamy.
Można wyróżnić dwa podstawowe rodzaje metod bioindykacyjnych. Pierwszy, tzw. środowiskowy, ma na celu ocenę stanu środowiska przyrodniczego oraz wpływu substancji chemicznych, zwłaszcza pestycydów, detergentów oraz metali ciężkich, na różne organizmy żywe, drugi dotyczy głównie człowieka. Bioindykatory, specjalnie wyselekcjonowane pod kątem szczególnie wysokiej wrażliwości, wprowadzone zostały w wielu krajach do rutynowych badań wód i służą do zabezpieczenia ujęć wody pitnej przed przypadkowym bądź umyślnym zanieczyszczeniem.
W biotestach, służących do badania toksyczności wody lub ścieków, stosuje się bioindykatory zwierzęce, roślinne i bakteryjne. Poniżej przedstawiamy pięć przykładowych testów, zaprezentowanych w trakcie pokazów w naszym laboratorium.
Test przy użyciu Selenastrum capricornutum. W teście wykorzystywany jest jednokomórkowy glon, należący do gromady zielenic, rozpowszechniony w wodach słodkich. Do hodowli glonów wprowadza się badane próbki wód powierzchniowych, a następnie prowadzi się spektrofotometryczne pomiary absorbancji w zakresie widzialnym. Toksyczne oddziaływanie badanej próbki powoduje zahamowanie przyrostu glonów, co można ilościowo mierzyć w odniesieniu do próbki kontrolnej. Przeciwny efekt testowy, czyli nadmierny wzrost glonów, jest także niekorzystny, bo może świadczyć o obecności substancji biogennych, jak nawozy czy fosforany ze środków piorących. Metodyka oparta jest na normie ISO 8692:1989.
Test przy użyciu Daphna magna. Rozwielitka jest skorupiakiem żyjącym w wodach słodkich. Stanowi dobry bioindykator z uwagi na łatwość hodowli oraz dużą wrażliwość na obecność wielu substancji toksycznych, w szczególności insektycydów, na które reaguje już w stężeniach 0,0001 mg/l. Efektem testowym jest unieruchomienie organizmu. Dafnie są często wykorzystywane w układach przepływowych w stacjach zabezpieczających ujęcia wody pitnej. Metodyka została oparta na normie ISO 6341:1996.
Test przy użyciu Artemia salina. Artemia, inaczej solowiec, jest skorupiakiem żyjącym w wodach słonych. Charakteryzuje się mniejszą wrażliwością niż dafnia, lecz jego niewątpliwą zaletą jest możliwość uzyskiwania młodych organizmów z jaj przetrwalnych. Aby uzyskać wylęg Artemii należy dzień przed wykonaniem testu umieścić jaja w specjalnej pożywce. Dzięki temu nie jest konieczne prowadzenie kosztownej, ciągłej hodowli bioindykatorów.
Test Spirotox. Organizmem testowym jest pierwotniak z grupy orzęsków - Spirostomum ambiguum, występujący w małych, czystych stawach. Orzęski umieszczane są w badanej próbce w płaskich naczyniach i obserwowane pod niewielkim powiększeniem (8 x). Po wpływem toksykantów komórki organizmów ulegają rozpuszczeniu, tzw. lizie. Bioindykator jest szczególnie wrażliwy na metale ciężkie, fungicydy (środki grzybobójcze) i detergenty. Z uwagi na niewielkie rozmiary organizmów reakcja przebiega szybko - oznaczenie trwa kilkanaście do kilkudziesięciu minut.
Test Microtox. Test polega na pomiarze naturalnej luminescencji (świecenia) bakterii Vibrio fischeri, które są zawieszone w badanej próbce. Toksyczne związki chemiczne hamują aktywność enzymów bakteryjnych, co manifestuje się obniżeniem intensywności świecenia. Jest to najszybszy test bioindykacyjny - wyniki uzyskujemy już po 5 minutach. Jego wadą jest konieczność zastosowania kosztownej aparatury, tzw. luminometru. Metodyka oparta jest na normie ISO 11348:1998.

¹ Zakład Farmakodynamiki, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Krakowskie Przedmieście 26/28, 00-325 Warszawa, e-mail: <maknow@amwaw.edu.pl>; kierownik: prof. dr hab. Stanisław W. Gumułka.
² Katedra i Zakład Chemii Organicznej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel. 572 0643, kierownik prof. ndzw. dr hab. Dorota Maciejewska.
³ Zakład Chemii Fizycznej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel. 5720 961, kierownik prof. ndzw. dr hab. Iwona Wawer.
⁴ Katedra i Zakład Farmakognozji, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 985, kierownik: prof. ndzw. dr hab. Józef Kowalski.
⁵ Katedra i Zakład Biologii i Botaniki Farmaceutycznej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 984, kierownik: prof. ndzw. dr hab. Olga Olszowska.
⁶ Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 737, kierownik: prof. dr hab. Jan Pachecka.
⁷ Zakład Farmacji Stosowanej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 978, kierownik: prof. ndzw. dr hab. Edmund Sieradzki.
⁸Zakład Badania Środowiska, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel. 5720 738, kierownik: prof. ndzw. dr hab. Józef Sawicki.