TEMATYKA POKAZÓW
W LABORATORIACH

VII FESTIWAL NAUKI 
Wydział Farmaceutyczny AM w Warszawie

Studia farmaceutyczne w okresie globalizacji
Wykład wprowadzający
(prof. dr hab. Jan Pachecka)¹

W przededniu wejścia Polski do Unii Europejskiej istnieje potrzeba dalszego stopniowego dostosowywania programu studiów do europejskich standardów. Absolwenci studiów farmaceutycznych już obecnie przygotowywani są w szerokim zakresie nie tylko do współpracy z lekarzami w dziedzinie farmakoterapii i fitoterapii, ale także do pracy badawczej nad opracowywaniem nowych generacji farmaceutyków, nad uzyskiwaniem leków ze źródeł naturalnych, technologią środków leczniczych i postaci leku oraz profilaktyką polegającą na korekcie modelu zachowań i odżywiania. Praca w aptece także nie ogranicza się do dystrybucji leków przepisanych przez lekarza, ponieważ stale rośnie liczba specyfików, wydawanych bez recepty. Obserwuje się wzrost społecznego zapotrzebowania na sprzedawane „od ręki” preparaty, do których zalicza się nie tylko niektóre leki, ale także odżywki, suplementy i wyciągi ziołowe. Często ludzie cierpiący na alergię, przemęczenie, stres, nadwagę czy nawracające przeziębienia kierują się wprost do apteki, i wtedy specjalistyczna konsultacja odpowiednio przygotowanego farmaceuty jest nie do przecenienia.
Nowoczesny program nauczania farmacji uwzględnia te wszystkie wielorakie wyzwania, jakie niesie szybki rozwój cywilizacyjny. 
W trakcie wykładu została zaprezentowana specyfika tego kierunku studiów i kierunki zmian programowych, wprowadzanych przed wstąpieniem Polski do Unii Europejskiej.

Nowoczesne diagnozowanie alergii
(dr Sławomir Białek)²

Diagnostyka laboratoryjna jest działem medycyny zajmującym się dostarczaniem informacji ułatwiających bądź umożliwiających rozpoznanie i różnicowanie chorób, oraz prognozowanie i monitorowanie leczenia. W przypadku chorób alergicznych diagnoza przede wszystkim opiera się na wynikach prawidłowo zebranego wywiadu oraz na wynikach testów skórnych. Często zdarza się jednak, że obraz kliniczny nie jest potwierdzony dodatnim wynikiem testów skórnych i w takich przypadkach konieczne jest wykonanie badań laboratoryjnych, czyli oznaczenia w surowicy krwi całkowitego stężenia IgE (immunoglobuliny E) oraz stężenia immunoglobulin alergenowoswoistych.
Stężenie immunoglobuliny E w surowicy krwi jest parametrem niezwykle charakterystycznym dla procesu alergicznego. Już u małych dzieci (od trzeciego roku życia), u których obserwuje się objawy alergii pokarmowej, można wykonać oznaczenie IgE. Wysoki poziom IgE obserwuje się także u młodych dorosłych z objawami alergii na alergeny wziewne, a także u pacjentów z astmą atopową. 
W trakcie tegorocznego Festiwalu Nauki w trakcie pokazów laboratoryjnych została zaprezentowana nowoczesna metoda oznaczania IgE alergenowoswoistych.

Hodowla tkanek roślin leczniczych in vitro
(przygotowanie: prof. dr hab. Mirosława Furmanowa, dr Hanna Olędzka, 
prowadzenie: dr Hanna Olędzka, mgr Wojciech Szypuła)³

Naturalnym środowiskiem bytowania roślin, z którym stykamy się najczęściej, jest gleba. Obecnie istnieje jeszcze inna możliwość hodowli roślin - w warunkach sterylnych, przy zastosowaniu pożywki agarowej zamiast ziemi. W takim przypadku mówimy o hodowli in vitro, czyli w szkle. Metoda ta jest m. in. stosowana do szybkiego klonalnego mnożenia roślin, tj. otrzymywania wielu okazów potomnych z tkanki jednej rośliny. Istnieje także możliwość osobnego hodowania wyodrębnionych organów i tkanek roślinnych, np. samych korzeni, zarodków lub komórek. Ponadto, zamiast roślin lub ich organów można również hodować niezróżnicowaną tkankę, nazywaną kalusem, lub prowadzić hodowlę komórek w zawiesinie w tzw. bioreaktorach. W tkankach wyhodowanych in vitro występują na ogół takie same związki biologicznie czynne, jak w roślinie macierzystej, co umożliwia otrzymanie ich z pominięciem hodowli całej rośliny. Najlepsze wyniki uzyskuje się z kultury zawiesinowej w bioreaktorach, w których parametry wzrostu są kontrolowane i rejestrowane na monitorze.
Według jednej z najnowszych metod, związki lecznicze otrzymuje się z korzeni transgenicznych, tzn. mających wprowadzony obcy gen. Do modyfikacji genotypu używa się bakterii o nazwie Agrobacterium rhizogenes. Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO) otrzymywane są obecnie z bakterii, grzybów, roślin i zwierząt. Dostarczają one m.in. wielu produktów żywnościowych, obecnych na naszym rynku. Zasady postępowania regulowane są specjalnymi przepisami, według których na opakowaniu powinna być informacja, że artykuł pochodzi z roślin zmienionych genetycznie.
Hodowla tkankowa roślin in vitro pozwala także otrzymywać rośliny haploidalne (z pojedynczym zespołem chromosomów), oraz dokonywać fuzji protoplastów (nieobłonionych komórek) dwóch gatunków, nie dających mieszańców w stanie naturalnym. Tkanki można również zamrażać i przechowywać w temperaturze ciekłego azotu (-196^oC), a po powolnym rozmrożeniu kontynuować hodowlę. Można również otoczkować tkanki merystematyczne i przechowywać w stanie niezmienionym w niskiej temperaturze dodatniej.
Obecnie przedmiotem prac Katedry są różne gatunki cisa i inne rośliny nie rosnące masowo w Polsce. Cis zawiera ok. 350 związków chemicznych, z których wiele jest trujących, natomiast jeden, zwany paklitakselem, wykazuje właściwości przeciwnowotworowe. Związek ten powstaje również w hodowli in vitro. Jego obecność stwierdziliśmy także w korzeniach transformowanych. Ponadto badanych jest kilkanaście gatunków roślin leczniczych nie występujących w Polsce.
Biotechnologia jest przedmiotem zajęć dydaktycznych i badań naukowych dwóch Katedr Wydziału Farmaceutycznego - Katedry i Zakładu Biologii i Botaniki Farmaceutycznej, która zajmuje się biotechnologią roślinną oraz Katedry Technologii Środków Leczniczych, który zajmuje się biotechnologią mikroorganizmów. Hodowla tkankowa roślin leczniczych, biotechnologia roślinna o rosnącym znaczeniu praktycznym - czeka na badaczy.
W trakcie pokazu zostały zademonstrowane hodowle tkankowe w bioreaktorach oraz hodowle roślin transgenicznych. Nie zabrakło również czasu na dyskusję o uzyskiwaniu związków biologicznie czynnych z roślin.

Substancje lecznicze z grzybów hodowlanych
(dr Olgierd Lubiński)⁴

Człowiek od dawna wykorzystywał substancje aktywne biologicznie, zawarte w grzybach, np. przykładano na rany chleb zagnieciony z pajęczyną, zawierający Penicillum notatum, hubę i sporysz stosowano do hamowania krwawień, a grzyby halucynogenne używano w obrzędach magicznych. Źródła pisane o stosowaniu grzybów pochodzą z ok. 2000 roku przed Chrystusem, a w Europie leczenie grzybami jako pierwszy opisał Hipokrates.
Ostatnio zyskuje na znaczeniu hodowla grzybów w bioreaktorach. Takie postępowanie celowe jest ze względu na postępujące zanieczyszczenie środowiska, np. podwyższony poziom pierwiastków radioaktywnych, jak cez i stront, a także zakwaszenie gleby i obniżenie poziomu wód gruntowych, co jest przyczyną coraz rzadszego występowania grzybów w naszych lasach. Grzyby hoduje się w postaci biomasy - jest to tzw. produkcja głębinowa, do której wytypowano azjatyckie gatunki grzybów ze względu na ich właściwości lecznicze, a z gatunków europejskich wybrano smardza. Uzyskany produkt może mieć nawet korzystniejsze właściwości niż grzyby rosnące w lasach ze względu na dobór optymalnych warunków hodowli. W wyniku odpowiedniego wzbogacania pożywki można wpływać na końcowy skład grzybni, np. doświadczalnie dobrane pożywki stanowią bogatsze źródło węgla, azotu i mikroelementów niż ściółka leśna, a wytworzona biomasa zawiera więcej białek, aminokwasów, lipidów, nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin niż produkt naturalny. Występują w niej także pomocne w trawieniu enzymy oraz chityna, która wiąże nadmiar cholesterolu i wpływa korzystnie na przemianę materii. Tego rodzaju wzbogacona biomasa może być stosowana np. do wytwarzania suplementów leczniczo-odżywczych lub pasz dla zwierząt hodowlanych. To ostatnie zastosowanie zyskuje na znaczeniu w aspekcie deficytu dodatków do pasz po wyeliminowaniu mączek mięsno-kostnych w następstwie krowiej epidemii BSE.
W naszym Zakładzie udało się uzyskać optymalne zawartości organicznie związanych, a więc łatwo przyswajalnych biopierwiastków, np. żelaza, manganu, cynku, kobaltu i selenu. W azjatyckich gatunkach grzybów występują substancje o działaniu cytostatycznym, które identyfikujemy i oznaczamy ilościowo. Szczególnie interesujące jest występowanie fitohormonów, które mogą być z powodzeniem stosowane w terapii człowieka, nie powodując znanych skutków ubocznych, typowych dla hormonów zwierzęcych, jak np. nowotwory u kobiet.
W trakcie pokazu zostały zademonstrowane fermentory z hodowlą grzybów, a także urządzenia do wirowania, suszenia i analizowania biomasy. Odbyła się prelekcja wprowadzająca i dyskusja.

Przygotowanie kremu dla młodzieży
(mgr Anna Żebrowska-Szulc, dr Barbara Chałasińska)⁵

Działanie kremów kosmetycznych, przeznaczonych do pielęgnacji skóry, polega na jej natłuszczaniu, nawadnianiu i odżywianiu, a w rezultacie na uelastycznieniu i wygładzeniu. Wartość odżywczą kremów podnosi dodatek substancji biologicznie czynnych: witamin, aminokwasów, hormonów, enzymów, kompleksów białkowych oraz wyciągów roślinnych.
Krem-żel dla młodzieży, który otrzymano w trakcie pokazu, działa łagodnie złuszczająco, przeciwtrądzikowo i przeciwłojotokowo. Podstawowymi składnikami kremów tego typu są substancje o działaniu antyseptycznym, przeciwzapalnym i ściągającym. Wyciąg z wierzby czarnej (Salix nigra), wchodzący w skład w/w kremu, zawiera salicylany, powodujące złuszczanie i regenerację naskórka. Dodatkowo garbniki obecne w wyciągu wykazują działanie antyoksydacyjne i wpływają pozytywnie na sprężystość skóry. 

Ocena toksyczności środowiska przy użyciu organizmów wodnych
(dr Grzegorz Nałęcz-Jawecki)⁶

Bioindykacja jest metodą wykorzystującą jako wskaźnik organizm żywy, którego reakcja jest podstawą oceny stopnia toksyczności badanego środowiska. Organizmy testowe, zwane bioindykatorami, powinny być szczególnie wrażliwe na związki chemiczne szkodliwe dla środowiska i dla człowieka, a w celu poprawienia tych właściwości są one często modyfikowane genetycznie. Badanie przy ich zastosowaniu stanowi rodzaj alarmu, ostrzegającego przed przypadkowym bądź umyślnym skażeniem, i pozwala na ocenę całkowitej toksyczności próbki. Bioindykację można więc traktować jako wstęp do analizy chemicznej, która pozwala na wykrycie obecności tylko tych związków, których się spodziewamy. 
Można wyróżnić dwa podstawowe rodzaje metod bioindykacyjnych. Pierwszy, tzw. środowiskowy, ma na celu ocenę stanu środowiska przyrodniczego oraz wpływu substancji chemicznych, zwłaszcza pestycydów, detergentów oraz metali ciężkich, na różne organizmy żywe, drugi dotyczy głównie człowieka. Bioindykatory, specjalnie wyselekcjonowane pod kątem szczególnie wysokiej wrażliwości, wprowadzone zostały w wielu krajach do rutynowych badań wód i służą do zabezpieczenia ujęć wody pitnej przed przypadkowym bądź umyślnym zanieczyszczeniem. Jeden z takich systemów, wykorzystujący dafnie, zabezpieczał ujęcia wody pitnej w czasie olimpiady w Salt Lake City.
W biotestach, służących do badania toksyczności wody lub ścieków, stosuje się bioindykatory zwierzęce, roślinne i bakteryjne. Poniżej przedstawiamy pięć testów, które zostały zaprezentowane w trakcie pokazów w naszym laboratorium.
Test przy użyciu Selenastrum capricornutum. W teście wykorzystywany jest jednokomórkowy glon, należący do gromady zielenic, rozpowszechniony w wodach słodkich. Do hodowli glonów wprowadza się badane próbki wód powierzchniowych, a następnie prowadzi się spektrofotometryczne pomiary absorbancji w zakresie widzialnym. Toksyczne oddziaływanie badanej próbki powoduje zahamowanie przyrostu glonów, co można ilościowo mierzyć w odniesieniu do próbki kontrolnej. Przeciwny efekt testowy, czyli nadmierny wzrost glonów, jest także niekorzystny, bo może świadczyć o obecności substancji biogennych, jak nawozy czy fosforany ze środków piorących. Metodyka oparta jest na normie ISO 8692:1989.
Test przy użyciu Daphna magna. Rozwielitka jest skorupiakiem żyjącym w wodach słodkich. Stanowi dobry bioindykator z uwagi na łatwość hodowli oraz dużą wrażliwość na obecność wielu substancji toksycznych, w szczególności insektycydów, na które reaguje już w stężeniach 0,0001 mg/l. Efektem testowym jest unieruchomienie organizmu. Dafnie są często wykorzystywane w układach przepływowych w stacjach zabezpieczających ujęcia wody pitnej. Metodyka została oparta na normie ISO 6341:1996.
Test przy użyciu Artemia salina. Artemia, inaczej solowiec, jest skorupiakiem żyjącym w wodach słonych. Charakteryzuje się mniejszą wrażliwością niż dafnia, lecz jego niewątpliwą zaletą jest możliwość uzyskiwania młodych organizmów z jaj przetrwalnych. Aby uzyskać wylęg Artemii należy dzień przed wykonaniem testu umieścić jaja w specjalnej pożywce. Dzięki temu nie jest konieczne prowadzenie kosztownej, ciągłej hodowli bioindykatorów.
Test Spirotox. Organizmem testowym jest pierwotniak z grupy orzęsków - Spirostomum ambiguum, występujący w małych, czystych stawach. Orzęski umieszczane są w badanej próbce w płaskich naczyniach i obserwowane pod niewielkim powiększeniem (8 x). Po wpływem toksykantów komórki organizmów ulegają rozpuszczeniu, tzw. lizie. Bioindykator jest szczególnie wrażliwy na metale ciężkie, fungicydy (środki grzybobójcze) i detergenty. Z uwagi na niewielkie rozmiary organizmów reakcja przebiega szybko – oznaczenie trwa kilkanaście do kilkudziesięciu minut.
Test Microtox. Test polega na pomiarze naturalnej luminescencji (świecenia) bakterii Vibrio fischeri, które są zawieszone w badanej próbce. Toksyczne związki chemiczne hamują aktywność enzymów bakteryjnych, co manifestuje się obniżeniem intensywności świecenia. Jest to najszybszy test bioindykacyjny – wyniki uzyskujemy już po 5 minutach. Jego wadą jest konieczność zastosowania kosztownej aparatury, tzw. luminometru. Metodyka oparta jest na normie ISO 11348:1998.

Rekombinacja genetyczna in vitro w otrzymywaniu leków
(dr Renata Wolinowska, dr Bohdan J. Starościak)⁷

Ważnym zastosowaniem inżynierii genetycznej jest konstruowanie szczepów bakterii i grzybów, które następnie mogą być użyte do produkcji substancji leczniczych, odczynników diagnostycznych lub innych ważnych produktów. Do genomu łatwych do hodowli i bezpiecznych drobnoustrojów wprowadza się geny, odpowiedzialne za biosyntezę pożądanych substancji, czyli aktywnych białek.
W trakcie pokazu przedstawiono sposoby postępowania, prowadzące do uzyskania takich produkcyjnych drobnoustrojów. Są to szczepy bakterii, wytwarzające enzymy stosowane jako leki przeciwzawałowe i służące do oczyszczania ran (streptokinaza i streptodornaza), oraz drożdże, produkujące wirusowe antygeny, np. szczepionki.
Streptokinaza i streptodornaza są enzymami, wytwarzanymi przez chorobotwórcze paciorkowce, warunkującymi m. in. patogenne działanie tych bakterii. Bezpieczny szczep produkcyjny uzyskuje się po wprowadzeniu genów biosyntezy tych enzymów do bakterii niechorobotwórczych. Wyizolowane i oczyszczone enzymy można wykorzystać do rozpuszczania skrzepów i usuwania zatorów naczyniowych. 
W przypadku niektórych groźnych chorób zakaźnych, np. wirusowego zapalenia wątroby typu B, poważnym problemem było uzyskanie bezpiecznej szczepionki, tzn. nie zawierającej nawet fragmentów materiału genetycznego wirusa. Obecnie stosowane szczepionki otrzymano wprowadzając gen biosyntezy wirusowego białka (antygenu) do komórek drożdży. W szczepionce znajduje się oczyszczone białko wirusowe, produkowane przez niechorobotwórcze drożdże. 
Stosując opisane wyżej metody obecnie opracowuje się szczepionki przeciwko różnym zarazkom, także takie, które można będzie podawać doustnie.

¹ Dziekan Wydziału Farmaceutycznego, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, dziekanat: tel./faks (+22) 5720 787.
² Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 737, kierownik: prof. dr hab. Jan Pachecka.
³ Katedra i Zakład Biologii i Botaniki Farmaceutycznej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720984, kierownik: prof. ndzw. dr hab. Olga Olszowska.
⁴ Katedra i Zakład Technologii Środków Leczniczych, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 647, kierownik: prof. dr hab. Bożenna Gutkowska.
⁵ Zakład Farmacji Stosowanej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel./faks 5720 978, kierownik: prof. dr hab. Edmund Sieradzki.
⁶ Zakład Badania Środowiska, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa, tel. 5720 738, kierownik: prof. dr hab. Józef Sawicki. 
⁷ Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie, 02-007 Warszawa, ul. Oczki 3, tel. 628 0822, kierownik: dr Bohdan J. Starościak. Pokaz przygotowany przy współpracy Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie.